近年來(lái)，釋放到生態(tài)系統(tǒng)中的神經(jīng)活性化合物數(shù)量不斷增加，人們對(duì)評(píng)估相關(guān)潛在生態(tài)和人類健康風(fēng)險(xiǎn)的興趣日益濃厚。事實(shí)上，許多化學(xué)污染物通常會(huì)對(duì)多種生物產(chǎn)生神經(jīng)毒性。據(jù)估計(jì)，所有商業(yè)使用的化學(xué)品中，多達(dá)30%可能具有神經(jīng)毒性潛力。此外，環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)可能以低濃度存在，超出儀器檢測(cè)限，也可能形成具有未知影響的混合物。
為了研究具有神經(jīng)毒性潛力的化學(xué)污染物對(duì)生態(tài)和人類健康的影響，通過(guò)動(dòng)物的早期生命階段進(jìn)行探究是一種強(qiáng)有力的途徑。在這個(gè)方式中，魚(yú)類已被證明是非常有益的。斑馬魚(yú)胚胎表現(xiàn)出的自發(fā)性卷尾是神經(jīng)毒性評(píng)估的另一個(gè)重要方式。在本研究中，研究者們?cè)u(píng)估了基于自發(fā)尾部運(yùn)動(dòng)的卷尾活性測(cè)試（CAT）的能力和可靠性，將卷尾活性測(cè)試應(yīng)用于斑馬魚(yú)胚胎，檢測(cè)不同環(huán)境水樣中的潛在神經(jīng)毒性作用。
斑馬魚(yú)胚胎作為研究模型
斑馬魚(yú)幼魚(yú)和胚胎是研究生態(tài)毒性的模型。該模型在實(shí)驗(yàn)室中使用簡(jiǎn)單，可擴(kuò)展性強(qiáng)。評(píng)估斑馬魚(yú)胚胎的尾部運(yùn)動(dòng)（卷尾）是一種篩查毒素引起的發(fā)育神經(jīng)毒性的技術(shù)。斑馬魚(yú)胚胎的這些自發(fā)尾部運(yùn)動(dòng)是生態(tài)神經(jīng)毒理學(xué)研究的有效讀數(shù)，因?yàn)樗梢钥焖俸Y查環(huán)境中是否存在有害的神經(jīng)毒性化學(xué)物質(zhì)。
Lacchetti等人評(píng)估了卷尾活性測(cè)試(CAT)的效率和可靠性。主要監(jiān)測(cè)自發(fā)尾部運(yùn)動(dòng)，因?yàn)檫@可以識(shí)別水中潛在的神經(jīng)毒性作用。研究者通過(guò)將這種方法與魚(yú)胚胎急性毒性測(cè)試(FET)進(jìn)行了比較，后者是一種更常用于確定水環(huán)境中急性毒害魚(yú)類的化學(xué)物質(zhì)濃度的方法。通常，斑馬魚(yú)胚胎用該方法確定在暴露于化學(xué)物質(zhì)96小時(shí)后50%的胚胎死亡（即致命）的濃度。
卷曲活動(dòng)測(cè)試的好處是什么
與魚(yú)胚胎急性毒性測(cè)試(FET)相比，使用卷尾活性測(cè)試(CAT)的好處在于篩查速度非常快（可在24小時(shí)內(nèi)完成），但更重要的是，CAT并不關(guān)注致死率本身，而是關(guān)注行為改變。因此，這強(qiáng)調(diào)了可能的神經(jīng)活性或神經(jīng)毒性作用，這些作用可能產(chǎn)生終身和相當(dāng)大的生態(tài)后果。
材料與方法
卷尾活性測(cè)試(CAT)操作方案分為三個(gè)步驟：
胚胎選擇和設(shè)置培養(yǎng)板
記錄和視頻捕捉
視頻分析
將CAT與FET一起應(yīng)用于不同的環(huán)境河流樣本（R1、R2、R3）和三種濃度逐漸降低的化合物（C1、C2、C3），以測(cè)試該方法的可行性。測(cè)試了三種不同濃度的水生環(huán)境：標(biāo)準(zhǔn)淡水（陰性對(duì)照）、1%乙醇和5%乙醇分別作為過(guò)度活躍和低活躍的參考。乙醇在低于2%的劑量下產(chǎn)生過(guò)度活躍，在高于4%的濃度下產(chǎn)生低活躍。
胚胎在96孔板中，于黑暗下在26°C孵化約22小時(shí)，使胚胎進(jìn)入23 hpf階段，胚胎尾部的自發(fā)活動(dòng)在23 hpf左右發(fā)生的頻率最高。錄制視頻然后使用諾達(dá)思的斑馬魚(yú)微視行為分析系統(tǒng)（DanioScope）記錄和分析了胚胎的視頻。其中，爆發(fā)活性（Burst activity）、平均爆發(fā)持續(xù)時(shí)間（mean burst duration）和爆發(fā)次數(shù)/分鐘（burst count/minute）是DanioScope評(píng)估的三個(gè)關(guān)鍵測(cè)量指標(biāo)，用于表征卷尾活性運(yùn)動(dòng)。
結(jié)果
表1顯示了兩種方法的主要對(duì)比結(jié)果。在FET中未顯示急性毒性（值≤10% 表示無(wú)毒性），而使用CAT對(duì)相同樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)檢測(cè)到了神經(jīng)毒性減退物質(zhì)（百分比值> 0）。同時(shí)可以看出，F(xiàn)ET和CAT很好地跟蹤了化合物濃度的下降，CAT也能突出物質(zhì)的過(guò)度神經(jīng)毒性（值<0），CAT測(cè)試在更短的時(shí)間內(nèi)被證明更敏感。
與FET測(cè)試相比，CAT版本具有一些優(yōu)勢(shì)，如表2所示。
總的來(lái)說(shuō)，通過(guò)測(cè)試Lacchetti等人證明了本研究中使用的卷尾活性測(cè)試(CAT是一種檢測(cè)潛在神經(jīng)毒性的有效且快速的預(yù)警系統(tǒng)。
參考文獻(xiàn)
Lacchetti, I, Christiano W., di Domenico K., Carere, M., Mancini, L. (2022). Coiling tail activity in zebrafish embryo: a protocol for an early warning system of neurotoxic substances. Fresenius Environ. Bulletin 31(08A/2022):8427-8434
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